一种用不混溶流体之间的界面构建微流控阵列的方法。
Introduction
思路：
微流控在主流生物实验室的应用仍受到如下限制：
- 材料不适合细胞生长；
- 结构封闭，开放性差；
- 实验期间不能更改预先设定的几何形状；
- 制造和操作成本高；
- 实验流程通常与现有生物实验流程不一致。
开放式微流控系统如悬浮、空气和纸微流控，往往需要建立新的基于活细胞的检测方法，不与传统生物学材料与方法兼容。
另一种开放的方法是在标准微孔板的孔内形成水凝胶壁，但需要在接种细胞前就构建好阵列。
更有生物学意义的方法是在生物学家传统培养皿上形成排列。
宏观世界中用液体壁创建结构的想法是行不通的——重力使它们坍塌成水坑。因此，在宏观尺度和大多数微流体装置中，液体被保持在具有实心壁的腔室中。然而，随着长度尺度变得更小，界面力主导重力，使类似于固体材料的流体界面限制液体成为可能。
作者开发了一种在培养皿上构建与重配置微流控阵列的方法，以适应细胞生物学中使用的一些主要工作流程。
Methodology
- （A）将DMEM+10%胎牛血清添加到培养皿中，随后去除大部分培养基，留下覆盖底部的薄膜，在其上覆盖不混溶的碳氟化合物FC40，以防止培养基蒸发，且保持无菌环境。疏水和亲氟的触控笔【其具有由聚四氟乙烯（PTFE）或“Teflon”制成的锥形尖端】在底部移动以形成正方形图案。由于碳氟化合物优先润湿Teflon（与水相比），FC40被带到基底上并置换水相（因为它也优先润湿基底）。
- （B）不同的模式：
- （a）等间距的垂直和水平线创建一个阵列。随后将60 nL蓝色染料添加到选定的腔室中；形成了外围为正方形框，内部为“OXFORD”字样的图案。放大图（右）显示了有/无染料的单个腔室。
- （b）用触控笔形成两个正方形（一个比另一个稍大），然后在中间的空间手动添加染料，从而创建类似的图案；每个字母都是通过形成其侧面并再次手动填充内部而制成的。放大图显示字母“F”是一团连续的液体。
Reconfiguring microfluidic arrangements
- （1）打印初始图案：由外围的正方形，中间的三角形以及内部的圆形构成；
- （2-4）在每个腔室中加入不同的染料，染料被限制在FC40壁内；
- （5）在圆圈中加入更多的黄色染料；
- （6）加入3 μL黄色染料后，圆形边界线破裂，内容物溢出到三角形中；
- （7）加入24 μL后，三角形边界线破裂，内容物溢出到方形中。
- （8）从正方形中抽出60 μL；
- （9）一个新的图案被打印出来：由外围的正方形，中间的圆形以及内部的三角形构成；
- （10-12）像上面一样在三个不同的腔室里加入彩色染料。这些结果表明，FC40液壁可以被破坏并重建成任何所需的二维形状，并且它们可以有效地限制液体。
Building fluid walls around single cells and clones
- （A）在单个腔室接种单细胞之前构建液壁。在制作网格后，加入染料或细胞（鼠乳腺癌细胞NM18）。由于FC40对O2和CO2自由渗透，因此不影响细胞生长。
- （a）红色染料（600 nL）被添加到每个腔室中，以展示网格。
- （b）将0.2 cells/600 nL的培养基添加到每个腔室（因此只有少数腔室有一个细胞），培养8天后对腔室进行成像，中央腔室含有一个克隆（见放大图）。
- （B）在单克隆细胞周围建液壁。
- （a）红色染料（1 μL）被添加到皿里的各种形状中；
- （b）HEK细胞接到一个皿里（密度~1 cells/cm2），生长8天成为克隆。接下来除去大部分培养基，在表面留下一层薄膜，加入FC40，在克隆周围画出各种形状，用打印机在每个腔室中注入1 μL的培养基，收集图像。
Clone picking
- （A）克隆挑选方法：
- （a）玻璃支架——“参考板”上的位置用独特的标识符（即A1，A2…，B1…）标记，用于细胞克隆定位；
- （b）在“参考板”上放置有菌落（红色）的培养皿；
- （c） 根据位置由程序在选定的克隆（黑线）周围打印出液壁；
- （d）从腔室中取出克隆。
- （B）隔离一个克隆，HEK细胞以低密度接种（密度~1 cells/cm2），培养8天成克隆，将皿放在“参考板”上，并在选定的克隆周围建立液壁。
- （a）带有独特标识符的“参考板”；
- （b）背景为“参考板”的克隆及放大视图；
- （c）构建液壁后的克隆。
- （C）克隆挑选：
- （a）图为围绕一个活的克隆建立的方形液壁，先通过添加/回收1 μL PBS来清洗细胞，然后添加1 μL胰蛋白酶；
- （b）37℃下5 min，使细胞从培养皿表面分离，回收1 μL细胞悬液；
- （c）将取回的细胞接种到12孔微孔板中，常规培养5天，细胞贴壁并生长。
Fluid walls are effective barriers to drugs
- （A）在一个3×3的网格中，中心加入1 μL培养基，周围的培养基则含有浓度为10 μg/mL的Puromycin（一种小分子翻译抑制剂，可以杀死哺乳动物细胞），孵育24 h后用台盼蓝评估细胞活力，外围的细胞已经死亡（每个腔室超过60%），而中央的细胞仍活着（细胞死亡少于5%）。
- （B）将0.5 μL的培养基±TNF-α（浓度10 ng/mL）加入到图案中。由于该HEK细胞编码一个由TNF-α开启的启动子控制的GFP报告基因，它们在暴露于该细胞因子时发出绿色荧光。荧光图像显示，只有被处理的体积中的细胞发出绿色荧光。这些结果表明，液壁对这些药物形成了有效的屏障，并允许对生长在同一皿中的细胞进行并列比较。
Wound healing
（A）工作流程的示意图：
- （a）一层薄薄的培养基上覆盖着FC40；
- （b）并排打印两个腔室；
- （c）在腔室中涂上Matrigel或fibronectin（2 μL，1 μg/cm2，1 h），插图为一个腔室的图像；
- （d）破坏液壁，用3 mL培养基清洗培养皿，以去除未附着的涂层，HEK细胞（6×105）被接种至培养皿中；
- （e）24 h后，细胞形成单层，在表面上刮开一个伤口（0.4 mm×2 mm），以去除其路径上的细胞，用显微镜监测伤口的愈合。
（B-C）生长在Matrigel（B）或fibronectin（C）上的单层细胞的伤口图像。
- （a-b）伤口形成前后的图像；
- （c）24 h后，细胞生长使Matrigel和fibronectin的伤口宽度分别减少到<0.2 mm和<0.15 mm；
- （d）48 h后，伤口完全愈合。结果表明，可以利用液壁很容易被破坏/重建这一特点在同一个培养皿中同时检测两个伤口的愈合。
Matrigel，基质胶是一种由肉瘤细胞分泌的胶状蛋白混合物，经常用于细胞侵袭的研究；
fibronectin，纤连蛋白是细胞外基质的一种糖蛋白，可增强伤口愈合。
Discussion
展示了一个用于细胞生物学工作流程的液壁微流控平台，进行了在粘附细胞周围形成微流控排列，然后用于如细胞克隆、药物筛选和伤口愈合的概念验证。优点在于：
- 可以在生物学家熟悉的细胞培养皿上构建复杂的微流控阵列，能支持复杂的工作流程，这与传统的方法形成了鲜明的对比，后者通常需要对生物测定进行调整以适应预先设计的微流控设备；
- 使用该平台制作的微流控阵列有流体壁/天花板，能准确地、可重复地建造；
- 该平台是高度灵活和可定制的；
- 用流体壁取代固体壁具有开放式微流控技术的好处，如由于FC40的光学透明性，且对移液器尖端没有阻碍，因此在整个实验过程中，阵列中的所有点都是完全可见和可访问的；
- 腔室周围的界限是稳定的；
- 微流控阵列可以在实验中实时重新配置。
限制在于：
- 阵列仅限于两个维度；
- 液体壁不可避免地比固体壁更脆弱；
- 液体和表面必须匹配，以确保有稳定的界限。
Reference
Soitu C, Feuerborn A, Deroy C, et al. Raising fluid walls around living cells[J]. Science Advances, 2019, 5(6): eaav8002.
